Panel RT-PCR V Reálném čase Pro Detekci 2019-nCoV

2023 Autor: Stephanie Arnold | [email protected]. Naposledy změněno: 2023-11-26 09:30

Návod k použití

Ikona pdf verze pro tisk [PDF]

Obsah

• Úvod
• Vzorky
• Reagencie, spotřební materiál a požadavky na vybavení
• Extrakce nukleových kyselin
• Kontrola kvality
• rRT-PCR testy
• Interpretace výsledků testu
• Omezení testu
• Kontaktní informace

Úvod

Účel: Tento dokument popisuje použití RT-PCR v reálném čase (rRT-PCR) pro kvalitativní detekci in vitro 2019-nového Coronavirus (2019-nCoV) v respiračních vzorcích a séru. Sady primerů a sond 2019-nCoV jsou navrženy pro univerzální detekci koronavirů podobných SARS (test N3) a pro specifickou detekci 2019-nCoV (testy N1 a N2).

Omezení použití protokolu: Zde popsané testy rRT-PCR nebyly ověřeny pro jiné platformy nebo chemie než ty, které jsou popsány v tomto dokumentu.

Vzorky

Opatření v oblasti biologické bezpečnosti

Při práci s klinickými vzorky používejte vhodné osobní ochranné pomůcky (např. Pláště, rukavice, ochranu očí). Zpracování vzorků by mělo být prováděno v certifikovaném kabinetu biologické bezpečnosti třídy II podle pokynů pro úroveň biologické bezpečnosti 2 nebo vyšší. Další informace viz:

• Prozatímní pokyny pro sběr, manipulaci a testování klinických vzorků od vyšetřovaných osob (PUI) pro rok 2019 Nový Coronavirus (2019-nCoV) https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens.html
• 5. vydání biologické bezpečnosti v mikrobiologických a biomedicínských laboratořích k dispozici na adrese

Přijatelné vzorky

• Respirační vzorky včetně: nasofaryngeálních nebo orofaryngeálních aspirátů nebo výplachů, nasofaryngeálních nebo orofaryngeálních výtěrů, broncheoalveolárního výplachu, tracheálních aspirátů a sputa.

  Vzorky tampónů se shromažďují pouze na tamponech se syntetickou špičkou (jako je polyester nebo Dacron®) s hliníkovými nebo plastovými šachtami. Tampóny s alginátem vápenatým nebo bavlněné špičky s dřevěnými šachtami nejsou přijatelné

Manipulace se vzorky a skladování

• Vzorky mohou být skladovány při 4 ^o C až 72 hodin po odběru.
• Pokud se očekává zpoždění při extrakci, uložte vzorky při teplotě -70 ^o C nebo nižší.
• Extrahované nukleové kyseliny by měly být skladovány při -70 ^o C nebo nižších.

Kritéria odmítnutí vzorku:

• Vzorky neuchovávané při 2-4 ° C (≤ 4 dny) nebo zmrazené při -70 ° C nebo nižší.
• Neúplné označení vzorku nebo dokumentace.
• Nevhodný typ vzorku.
• Nedostatečný objem vzorku.

Reagencie, spotřební materiál a požadavky na vybavení

Zřeknutí se odpovědnosti: Názvy dodavatelů nebo výrobců jsou uvedeny jako příklady vhodných zdrojů produktů. Začlenění neznamená schválení středisky pro kontrolu a prevenci nemocí.

Činidla a spotřební materiál

• sady primerů / sond rRT-PCR
• Pozitivní kontrola šablony
• TaqPath ™ 1-Step RT-qPCR Master Mix, CG (ThermoFisher; kat. Č. A15299 nebo A15300)
• Voda molekulární kvality, bez nukleázy
• Jednorázové rukavice bez prášku
• Špičky P2 / P10, P200 a P1000 pro aerosolovou bariéru
• Sterilní zkumavky s mikrocentrifugou o obsahu 1, 5 ml bez nukleázy
• Proužky s 0, 2 ml PCR zkumavek nebo 96jamkové PCR reakční destičky v reálném čase a optické proužky s 8 uzávěry
• Laboratorní značkovací pero
• Chladicí stojany pro 1, 5 mikrocentrifugační zkumavky a 96-jamkové 0, 2 ml PCR zkumavky
• Stojany na 1, 5 ml zkumavky s mikrocentrifugou

• Přijatelné povrchové dekontaminační prostředky

  • DNAZap ^™ (Life Technologies, kat. Č. AM9890)
  • DNA Away ^TM (Fisher Scientific; kat. Č. 21-236-28)
  • RNAse Away ^TM (Fisher Scientific; kat. Č. 21-236-21
  • 10% bělidlo (1:10 ředění komerčního 5, 25-6, 0% chlornanu sodného)

Zařízení

• Pracovní stanice PCR [UV lampa; Laminární tok (filtrovaný 100 HEPA)]
• Vortex mixér
• Mikrocentrifuga
• Mikropipety (2 nebo 10 µl, 200 µl a 1000 µl)
• Vícekanálové mikropipety (5-50 µl)
• 2 x 96jamkové studené bloky
• -20 ^° C (nemrznoucí) a -70 ^° C mrazničky; 4 ^o C lednička
• Systém detekce PCR v reálném čase
• Extrakční systém nukleových kyselin

Extrakce nukleových kyselin

• Výkon testů založených na amplifikaci rRT-PCR závisí na množství a kvalitě vzorové RNA RNA. Před testováním vzorků by měly být postupy extrakce RNA kvalifikovány a validovány na výtěžnost a čistotu.
• Komerčně dostupné extrakční postupy, u nichž bylo prokázáno, že generují vysoce vyčištěnou RNA, když se postupují podle postupů doporučených výrobcem pro extrakci vzorků, zahrnují: systémy BioMérieux NucliSens®, QIAamp® Viral RNA Mini Kit, QIAamp® MinElute Virus Spin Kit nebo RNeasy® Mini Kit (QIAGEN), EZ1 DSP Virus Kit (QIAGEN), Roche MagNA Pure kompaktní izolační sada pro RNA, Roche MagNA Pure kompaktní sada pro izolaci nukleových kyselin a Roche MagNA Pure 96 DNA a virová NA malý objem Kit a Invitrogen ChargeSwitch® Total RNA Cell Kit.
• Zachovejte zbytkový vzorek a nukleový extrakt a okamžitě skladujte při -70 ^° C
• Rozmrazte pouze počet extraktů vzorků, které budou testovány za jeden den. Před testováním nezmrazujte / nerozmrazujte extrakty více než jednou.

Kontrola kvality

Kvůli citlivosti rRT-PCR by tyto testy měly být prováděny pomocí přísné kontroly kvality a postupů zajištění kvality. Dodržování těchto pokynů pomůže minimalizovat pravděpodobnost falešně pozitivního zesílení.

Obecné úvahy

• Personál musí být obeznámen s použitým protokolem a nástroji.
• Udržujte oddělené oblasti a vyhrazené vybavení (např. Pipety, mikrocentrifugy) a zásoby (např. Mikrocentrifugační zkumavky, pipetovací špičky, pláště a rukavice) pro stanovení reagentu a manipulaci s extrahovanými nukleovými kyselinami.
• Pracovní tok musí být vždy z čistého do špinavého prostoru.
• Během instalace testovacího činidla a manipulace s extrahovanými nukleovými kyselinami noste čisté jednorázové šaty a nové, dříve nepotřebné rukavice bez prášku. Při podezření na znečištění vyměňte rukavice.
• Skladujte primer / sondy a hlavní směs enzymů při vhodných teplotách (viz příbalové informace). Nepoužívejte činidla po uplynutí doby použitelnosti.
• Zkumavky s reagenciemi a reakce udržujte co nejvíce uzavřené.
• Očistěte a dekontaminujte povrchy.
• Do oblasti nastavení testu nepřiveďte extrahované nukleové kyseliny ani produkty PCR.
• Používejte pouze špičky pipety s aerosolovou bariérou (filtrem).
• Používejte pouze kryty stripů PCR. Nepoužívejte těsnicí fólie na PCR desky.

Kontroly zkoušek

• Kontrolní testy by měly být prováděny souběžně se všemi testovanými vzorky.
• PTC - pozitivní kontrola šablony s očekávaným rozsahem hodnot Ct
• NTC - negativní kontrola templátu přidaná během nastavení reakce rRT-PCR
• HSC - kontrola extrakce lidských vzorků extrahovaná souběžně se zkušebními vzorky; poskytuje procedurální kontrolu extrakce nukleové kyseliny a sekundární negativní kontrolu, která ověřuje postup extrakce nukleové kyseliny a integritu činidla
• RP - všechny klinické vzorky by měly být testovány na gen lidské RNAsy P (RNP), aby se vyhodnotila kvalita vzorku
• Poznámka: Pokračujte v zaznamenávání výkonu PTC. Po každém běhu klinických vzorků rRT-PCR by měly být zaznamenány kontrolní hodnoty Ct.

rRT-PCR testy

Příprava reagentu

Sady primerů / sond rRT-PCR (viz příbalový leták, pokud je poskytován společností CDC)

• Opatření: S těmito reagenciemi by se mělo zacházet pouze na čistém místě a skladovány při vhodných teplotách (viz níže) ve tmě. Je třeba se vyhnout cyklům zmrazování a rozmrazování. Při tání udržujte chlad.
• Za použití aseptické techniky se usušená činidla suspendují v 1, 5 ml vody bez nukleázy a nechají se rehydratovat po dobu 15 minut při teplotě místnosti ve tmě.
• Jemně promíchejte a alikvoty primerů / sond ve 300 μl objemech do 5 předem značených zkumavek. Uchovávejte jeden alikvot primerů / sond ve tmě při 2-8 ^° C. Chraňte před mrazem (stabilní až 4 měsíce). Zbývající alikvoty skladujte při teplotě ≤ -20 ^° C v mrazničce bez mrazu.

Pozitivní kontrola šablon (PTC) (pokud používáte pozitivní kontrolu CDC, nCoVPC, viz příbalový leták poskytnutý CDC)

• Opatření: S tímto činidlem by se mělo zacházet opatrně ve vyhrazené oblasti pro manipulaci s nukleovými kyselinami, aby se zabránilo možné kontaminaci. Je třeba se vyhnout cyklům zmrazování a rozmrazování. Při rozmrazování udržujte led.
• Používá se k hodnocení výkonu rRT-PCR testů. Vysušené činidlo se resuspenduje v každé zkumavce v 1 ml vody bez nukleázy, aby se dosáhlo správné koncentrace. Alikvoty pro jednorázové použití (přibližně 30 μL) a skladujte při ≤ -70 ° C.
• Rozmrazte jeden alikvot zředěné pozitivní kontroly pro každý experiment a držte na ledu, dokud se nepřidá na destičku. Zlikvidujte nepoužitou část alikvotu.
• NCoVPC také obsahuje lidskou DNA, která slouží jako pozitivní kontrola pro RP test.

Příprava zařízení

1. Před použitím očistěte a dekontaminujte všechny pracovní povrchy, pipety, odstředivky a další zařízení pomocí RNase Away® nebo 10% čerstvě připraveného bělidla.
2. Zapněte AB 7500 Fast DX a umožněte bloku dosáhnout optimální teploty.
3. Proveďte nastavení desky a vyberte na přístroji protokol o cyklování.
4. Nastavení přístroje: Detektor (FAM); Zhášeč (žádný); Pasivní reference: (Žádné); Provozní režim: (Standardní); Objem vzorku (20 µL)

Příprava zařízení

Krok	Cykly	Temp	Čas
Inkubace UNG	1	25 ° C	2 min
RT inkubace	1	50 ° C	15 min
Aktivace enzymu	1	95 ° C	2 min
Zesílení	45	95 ° C	3 sec
		55 ° C	30 sec

* Údaje o fluorescenci (FAM) by měly být shromažďovány během inkubačního kroku 55 ° C.

Reakční hlavní mix a nastavení desek

Poznámka: Konfigurace nastavení desek se může lišit v závislosti na počtu vzorků a organizaci pracovního dne. NTC a nCoVPC musí být zahrnuty v každém běhu.

1. V místnosti s čistícím prostředkem na reagenty umístěte r4X Master Mix a primer / sondy na led nebo blok chladu. Během přípravy a používání udržujte chlad.
2. Thaw 4X Reaction Mix před použitím.
3. Smíchejte 4X Master Mix a primer / sondy inverzí 5krát.
4. Krátce odstřeďte 4X Master Mix a primery / sondy a vraťte se do studeného bloku.
5. Označte jednu 1, 5ml mikrocentrifugační zkumavku pro každou sadu primerů / sond.

6. Určete počet reakcí (N), které se nastaví na test. Je nutné vytvořit přebytek reakční směsi pro reakce NTC, nCoVPC a RP a pro chybu pipetování. N určete pomocí následujícího průvodce:

   • Pokud se počet vzorků (n) včetně kontrol rovná 1 až 14, pak N = n + 1
   • Pokud je počet vzorků (n) včetně kontrol 15 nebo vyšší, pak N = n + 2
7. Pro každou sadu primerů / sond vypočítejte množství každého činidla, které má být přidáno pro každou reakční směs (N = # reakcí).

TaqPath ™ 1-Step RT-qPCR Master Mix

TaqPath ™ 1-Step RT-qPCR Master Mix

Krok #	Činidlo	Sv. přidaného činidla na reakci
1	Voda neobsahující nukleázy	N x 8, 5 ul
2	Kombinovaná směs primerů a sond	N x 1, 5 ul
3	TaqPathTM 1-Step RT-qPCR Master Mix (4x)	N x 5, 0 ul
	Celkový objem	N x 15, 0 ul

1. Do každé příslušné označené zkumavky s mikrocentrifugou o objemu 1, 5 ml přidejte reagencie. Po přidání reagencií promíchejte reakční směsi pipetováním nahoru a dolů. Nevírejte.
2. Centrifugujte po dobu 5 sekund, aby se shromáždil obsah na dně zkumavky, a poté vložte zkumavku do chladicího stojanu.
3. Zkumavky nebo destičky s reakčním proužkem umístěte do 96-jamkové chladicí stojany.
4. Vydejte 15 µL každé hlavní směsi do příslušných jamek procházejících řadou, jak je ukázáno níže (obrázek 1):

Obrázek 1: Příklad sestavení reakčních destiček Master Mix

1. Před přesunem do oblasti manipulace s nukleovými kyselinami připravte reakce No Template Control (NTC) pro kolonu č. 1 v oblasti přípravy testu.
2. Napipetujte 5 µl vody bez nukleázy do jamek pro vzorky NTC. Před pokračováním bezpečně uzavřete NTC jamky.
3. Zakryjte celou reakční desku a přesuňte reakční desku do oblasti manipulace se vzorkem nukleové kyseliny.

Přidání šablony

1. Zkumavky se vzorkem nukleové kyseliny jemně promíchejte po dobu přibližně 5 sekund.
2. Po odstředění umístěte extrahované zkumavky se vzorkem nukleové kyseliny do studeného stojanu.
3. Vzorky by měly být přidány do sloupce 2-11 (sloupce 1 a 12 jsou pro kontroly) ke specifickému testu, který je testován, jak je znázorněno na obrázku 2. Opatrně pipetujte 5, 0 µl prvního vzorku do všech jamek označených pro tento vzorek (tj. Vzorek „S1“dolů ve sloupci č. 2). Během přidávání udržujte další jamky vzorku zakryté. Změnit tipy po každém přidání.
4. Kolonu, do které byl vzorek přidán, bezpečně uzavřete, abyste zabránili křížové kontaminaci a zajistili sledování vzorku.
5. Rukavice vyměňujte často a v případě potřeby, aby nedošlo ke kontaminaci.
6. Opakujte kroky 3 a 4 pro zbývající vzorky.
7. Pokud je to nutné, přidejte do jamek HSC 5 µL vzorku extrahovaného z kontroly lidských vzorků (HSC) (obrázek 2, sloupec 11). Po přidání bezpečně uzavřete jamky
8. Zakryjte celou reakční desku a přesuňte reakční desku do oblasti manipulace s pozitivní kontrolou šablony.

Přidání kontroly testu

1. Napipetujte 5 µl nCoVPC RNA do jamek vzorku ve sloupci 12 (obrázek 2). Po přidání kontrolní RNA jamky bezpečně uzavřete.

   POZNÁMKA: Pokud používáte proužky s 8 zkumavkami, označte tabulku TAB každého proužku tak, aby byla uvedena poloha vzorku. NEDÁVEJTE NAHORU REAKČNÍ TRUBKY!

2. Proužky zkumavek s krátkou odstředivkou po dobu 10-15 sekund. Po odstředění se vraťte do studeného stojanu.

   POZNÁMKA: Pokud používáte 96-jamkové destičky, odstřeďte destičky po dobu 30 sekund při 500 xg, 4 ° C.

Obrázek 2. Diagnostický panel rRT-PCR 2019-nCoV rRT-PCR: Příklad nastavení vzorku a kontroly

^a Nahraďte vzorek v tomto sloupci v případě potřeby extrahovaným HSC

Analýza dat

Po dokončení běhu uložte a analyzujte data podle pokynů výrobce přístroje. Analýzy by měly být prováděny samostatně pro každý cíl pomocí ručního nastavení prahu. Mezní hodnoty by měly být upraveny tak, aby spadaly do exponenciální fáze fluorescenčních křivek a nad jakýkoli signál pozadí (viz obrázek 3). Postup zvolený pro stanovení prahu by měl být používán důsledně

Obrázek 3. Okno Amplification Plot

Interpretace výsledků testu

• NTC by měly být negativní a neměly by vykazovat křivky růstu fluorescence, které překračují prahovou linii.

  • Pokud se vyskytne falešně pozitivní reakce s jednou nebo více reakcemi NTC primeru a sondy, může dojít ke kontaminaci vzorku.

    Zrušte běh a opakujte test s přísnějším dodržováním pokynů pro postup

• Reakce PTC by měla přinést pozitivní výsledek s očekávanou hodnotou Ct pro každý cíl zahrnutý v testu.

  • Pokud se nedosáhne očekávané pozitivní reaktivity, zrušte platnost cyklu a opakujte test s přísnějším dodržováním pokynů pro postup.
  • Určete příčinu neúspěšné reaktivity PTC, implementujte nápravná opatření a dokumentujte výsledky vyšetřování a nápravných opatření.
  • Nepoužívejte PTC činidla, která negenerují očekávaný výsledek.

• RP by měl být pozitivní při 35 nebo před 35 cykly pro všechny klinické vzorky a HSC, což ukazuje na přítomnost dostatečné nukleové kyseliny z lidského genu RNázy P a že vzorek má přijatelnou kvalitu.

  • Pokud nedeteguje RNázu P v HSC, může to znamenat:

    • Nesprávné nastavení a provedení testu
    • Porucha činidla nebo zařízení

  • Detekce RNázy P v HSC, ale selhání detekce RNázy P v kterémkoli z klinických vzorků může naznačovat:

    • Nesprávná extrakce nukleové kyseliny z klinických materiálů, která má za následek ztrátu nukleové kyseliny nebo přenos inhibitorů PCR z klinických vzorků
    • Absence dostatečného množství lidského buněčného materiálu ve vzorku, který by umožnil detekci

• HSC by měla být negativní pro sady primeru / sondy specifické pro 2019-nCoV.

  • Pokud jakýkoli primer / sondy specifické pro 2019-nCoV vykazují růstovou křivku, která překračuje prahovou linii, interpretujte takto:

    • Může dojít ke kontaminaci činidel pro extrakci nukleových kyselin. Před dalším testováním znehodnoťte běh a potvrďte integritu činidla extrakčních činidel nukleových kyselin.
    • Křížová kontaminace vzorků nastala během postupů extrakce nukleových kyselin nebo nastavení testu. Zrušte běh a opakujte test s přísnějším dodržováním pokynů pro postup.
• Když všechny kontroly vykazují očekávaný výkon, vzorek je považován za negativní, pokud všechny růstové křivky prahového růstu cyklu 2019-nCoV (N1, N2, N3) nepřekračují prahovou hodnotu a růstová křivka RNase P NESKROUJE prahovou čáru.
• Když všechny kontroly vykazují očekávaný výkon, je vzorek považován za pozitivní na 2019-nCoV, pokud všechny prahové růstové křivky cyklu markerů (N1, N2, N3) překročí prahovou čáru. RNáza P může nebo nemusí být pozitivní, jak je popsáno výše, ale výsledek 2019-nCoV je stále platný.
• Když všechny kontroly vykazují očekávaný výkon a růstové křivky pro 2019-nCoV markery (N1, N2, N3) A marker RNázy P NESKRESUJÍ růstovou křivku prahové hodnoty cyklu, výsledek je neplatný. Extrahovaná RNA ze vzorku by měla být znovu testována. Pokud zbytková RNA není k dispozici, znovu extrahujte RNA ze zbytkového vzorku a opakujte test. Pokud je testovaný vzorek negativní pro všechny markery a všechny kontroly vykazují očekávaný výkon, výsledkem je „Neplatný“.
• Když všechny kontroly vykazují očekávaný výkon a růstovou křivku prahu cyklu pro kterýkoli jeden nebo dva markery (N1, N2, N3), ale ne všechny tři překračují prahovou čáru, výsledek není přesvědčivý pro 2019-nCoV. Znovu extrahujte RNA ze zbytkového vzorku a opakujte test.

Interpretace výsledků diagnostického panelu 2019-nCoV rRT-PCR

Interpretace výsledků diagnostického panelu 2019-nCoV rRT-PCR

2019 nCoV_N1	2019 nCoV_N2	2019 nCoV_N3	RP	Interpretace výsledků
+	+	+	±	Bylo zjištěno 2019-nCoV
Pokud je pouze jeden nebo dva ze tří cílů pozitivní			±	Bezkonkurenční výsledek
-	-	-	+	2019-nCoV nebyl detekován
-	-	-	-	Neplatný výsledek

Omezení testu

• Před provedením testu by analytici měli být školeni a seznámeni s postupy testování a interpretací výsledků.
• Falešně negativní výsledek může nastat, pokud je ve vzorku přítomen nepřiměřený počet organismů v důsledku nesprávného sběru, přepravy nebo manipulace.
• Zejména RNA viry vykazují podstatnou genetickou variabilitu. Přestože bylo vyvinuto úsilí navrhnout testy rRT-PCR pro konzervované oblasti virových genomů, variabilita vedoucí k chybným shodám mezi primery a sondami a cílovými sekvencemi může vést ke snížení výkonu testu a možných falešně negativních výsledků.